来源：《中国中药杂志》，网络首发日期：2022-07-08

脉络舒通丸治疗缺血性卒中的网络药理学分析和实验验证

杨永芳 ^1,2，彭善鑫 ²，王恺悦 ^1,2，朱崇田 ²，钟华胜 ^{3 通讯作者}，车峰远 ^{1,2 通讯作者}

（1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.临沂市人民医院，山东 临沂 276000；3. 抚州市第一人民医院，江西 抚州 344000）

卒中（stroke）是一组突然起病的脑血液循环障碍性疾病。数据显示，卒中是我国成人致死、致残的首位病因，具有发病率高、致残率高、病死率高和复发率高的特点。卒中分为缺血性和出血性卒中，前者发病率较高，占总数的70%以上。缺血性卒中的病因包括心脏栓子的脱落、颈动脉粥样硬化斑块或继发血栓的脱落，以及颈动脉的狭窄甚至闭塞。目前缺血性卒中治疗日益成熟，但在恢复期和后遗症期治疗仍较为局限，而中药“多靶点-多通路”的作用特点，备受肯定。缺血性卒中属于中医“中风”的范畴，国医大师任继学认为中风（缺血性卒中）是由于多种原因导致血脉瘀阻，经络不畅，发为偏枯，应用补气、活血、化瘀之法。《中国脑梗死中西医结合诊治指南2017》指出，中西医结合综合治疗，有利于提高卒中临床疗效，恢复期是中医治疗缺血性卒中的优势。活血类药物具有顺畅血行、活血通络等功效，可通过促进细胞血管活性物质的释放和内皮细胞增殖、减少细胞凋亡等机制保护血管内皮细胞。以黄芪、当归为君药和臣药的补阳还五汤是治疗中风之气虚血瘀证的代表方，五味通栓口服液基于补阳还五汤，在补气、活血、通络的基础上，配以破瘀血而不伤新血的水蛭为臣药，临床疗效显著。

脉络舒通丸/颗粒临床应用20年，由黄芪、金银花、当归、黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、白芍、甘草、水蛭、蜈蚣和全蝎12味中药组成，具有清热解毒、化瘀通络、祛湿消肿的功效。方中黄芪为君药，补中益气，当归合用白芍活血止痛，为臣药，水蛭、蜈蚣、全蝎攻毒散结、活络止痛，为佐药。“化瘀、通络、消肿”功效表明了脉络舒通丸治疗缺血性卒中的可行性，这对于卒中的防治具有重要意义。现代药理研究也证实其具有抗炎、保护血管内皮、抗血栓形成、调节血压等作用。因此，本研究采用网络药理学这一药物研究模式，筛选出脉络舒通丸治疗缺血性卒中的物质基础和作用靶点，通过大脑中动脉阻塞建立小鼠脑缺血模型，验证药物对模型动物的治疗作用机制，为脉络舒通丸治疗缺血性卒中的临床提供理论参考。

1.1网络药理学分析与分子对接

1.1.1脉络舒通丸有效成分及其靶点的筛选

利用中药系统药理学数据与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）及文献检索，查询脉络舒通丸各味中药的化学成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为 TCMSP 化学成分的筛选条件。通过 PubChem 数据库 （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到药物成分的 SMILES 字符串，输入 SwissTargetPrediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测成分的靶点，根据预测得分（probability）选取每个成分前20个靶点纳入成分靶点库中，同时删去预测得分为0的靶点，整理得到脉络舒通丸成分靶点库。

1.1.2脉络舒通丸治疗缺血性卒中靶点的获取和分析

在DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）中，以“ischemic stroke”为关键词检索缺血性卒中相关靶点。在 UniProt 数据库（http://www.uniprot.org/）中逐一查询成分靶点和疾病靶点对应的基因名称并汇总，将二者取交集，导入 STRING 数据库（https://string-db.org/）获取蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，通过 Cytoscape 3.8.0 软件可视化，并利用 CytoHubba 插件进行拓扑分析，将 degree、MNC（maximum neighborhood component）前 10 的靶点，取两者共有靶点即为核心靶点。

1.1.3基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

使用生物学信息注释数据库DAVID6.8平台（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）将脉络舒通丸治疗缺血性卒中的靶点进行GO和KEGG富集分析，利用R4.0.0软件将分析结果可视化。

1.1.4分子对接

通过TCMSP数据库及PubChem数据库得到脉络舒通丸成分的3D结构信息，同时通过PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获得靶蛋白的3D结构，使用AutoDockTool4.0和PyMOL2.3.4软件对成分和靶蛋白进行前处理，用AutoDock Vina 软件将处理后的成分与靶蛋白进行分子对接。

1.2 体内实验验证

1.2.1试剂与仪器

脉络舒通丸（批号918200011）购自鲁南厚普制药有限公司；磷脂酰肌醇激酶（PI3K）兔抗体（货号4292）、磷酸化磷脂酰肌醇激酶（p-PI3K）兔抗体（货号4228）、蛋白激酶B（AKT）兔抗体（货号9272）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）兔抗体（货号9271）、核因子κB（NF-κB）兔抗体（货号8242）、磷酸化核因子κB（p-NF-κB）兔抗体（货号3033）、β-actin抗体（货号3700）购自 Cell Signaling Technology。高通量动植物组织研磨机（型号1600MiniGTM，美国SPEX公司），电泳仪及转移槽（型号DYY-7C、DYCZ-40D，北京六一生物科技有限公司），化学发光成像系统（型号ChemiScope6200，上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.2.2动物

SPF级ICR雄性小鼠，体质量30~34g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(京)2016-0011，使用许可证号SYXK(鲁)2018-0008。研究严格按照动物伦理委员会要求执行。动物自然昼夜节律光照，适应性喂养3d后进行实验。

1.2.3动物造模、分组及给药

采用阻断大脑中动脉引起脑局部缺血法建立小鼠缺血性卒中模型，假手术组除不插入线栓外，其余操作同模型组。将小鼠随机分为假手术组、模型组、脉络舒通丸组（7.2g·kg^-1），每组10只。分组完成后，每天给药1次，连续7d。假手术组和模型组按照10mL·kg^-1灌胃纯化水，脉络舒通丸组灌胃等体积的药物。

1.2.4指标检测

末次给药后1h，麻醉处死小鼠，取小鼠大脑，切成4片，切片厚度约为2mm，浸泡在2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液中，37℃恒温避光15min。染色完成后，将脑片正反面拍照。梗死组织为白色，非梗死组织为红色，使用ImageJ软件进行图像分析并计算脑梗死体积占比。取侧脑室室下区，采用Western blot法检测组织中PI3K、AKT、NF-κB及其磷酸化蛋白的表达情况。

1.2.5统计学处理

使用SPSS20.0统计软件处理数据，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.1“成分-靶点-疾病”网络的分析

根据TCMSP数据库检索结果及文献检索，收集整理，删除PubChem数据库未收录成分和无靶点成分，共得到222个成分及其对应的701个靶点，各中药成分和靶点情况见表1。在DisGeNET数据库中，共筛选得到与缺血性卒中密切的靶点1079个，将之与脉络舒通丸成分靶点取交集，得到192个共同靶点。利用Cytoscape软件分析“脉络舒通丸中药-成分-靶点-缺血性卒中”网络，见图1，每条边则表示中药所含成分及成分与靶点相互作用关系，成分的代号以其“PubChemCID”表示。按照degree排名前10位的成分及其结构信息见表2。

2.2 PPI 网络分析

将192个共同靶点导入STRING数据库，筛选出结合评分≥0.9的靶点，剔除孤立靶点，得到包含153个靶点的PPI网络，运用CytoHubba插件分析，得到的degree和MNC前10的靶点，二者结果一致；运用MCODE插件进行子网络分析，得到分值最高（score=11.220）的子网络，与上述结果取交集，得到脉络舒通丸治疗缺血性卒中的核心靶点，见图2。9个核心网络靶点分别为AKT1、连环蛋白β1（CTNNB1）、活化蛋白1（JUN）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、MAPK3、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、磷酸肌醇3-激酶调节亚基1（PIK3R1）、细胞核因子κBp65蛋白（RELA）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）。

2.3 GO 功能分析和 KEGG 通路分析

通过 DAVID 数据库进行 GO 富集分析得到 GO 条目 515 个（P<0.01），其中生物过程（biological process）条目247个，包括信号转导、RNA聚合酶的正向和负向调节、基因表达的调节、蛋白质磷酸化、炎症反应等；细胞组成（cellular component）条目90个，包括细胞膜、细胞质、胞液、细胞核、核质等；分子功能（molecular function）条目178个，包括蛋白结合、ATP结合、酶结合、锌离子结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。各类别count前10位的条目见图3。

KEGG通路富集分析筛选得到137条通路（P<0.01），包括糖尿病并发症中的糖基化终末产物及其受体信号通路、脂质和动脉粥样硬化、癌症相关通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、阿尔茨海默病、神经退化通路等，其中脂质和动脉粥样硬化、PI3K/AKT、MAPK、肿瘤坏死因子、NF-κB、细胞凋亡、血小板激活等信号通路与脉络舒通丸治疗缺血性卒中密切相关。选count较大的前20条通路进行可视化，其中共32个靶点参与PI3K/AKT信号通路。

2.4 分子对接

选择表2中的成分作为配体，PI3K/AKT/NF-κB通路中的PIK3CA/PIK3R1（PDBID：4ovv）、AKT1（PDBID：6s9w）、RELA/NFKB1（PDBID：1nfi）作为受体，进行分子对接。结果表明，脉络舒通丸中的三萜类成分和黄酮类成分与上述受体结合较好，见表3。beta-sitosterol、glyuranolide、quercetin、lupiwighteone、gancaoninL等成分是脉络舒通丸治疗缺血性卒中的关键药效成分。

2.5 脉络舒通丸对小鼠的神经保护作用

小鼠脑组织TTC染色后，正常和梗死的脑组织分别为红色和白色，模型组小鼠脑组织出现明显脑梗死；与假手术组相比，模型组脑梗死体积占比明显升高（P<0.01）；与模型组相比，脉络舒通丸可显著降低脑梗死体积占比（P<0.01），见图5。

2.6 脉络舒通丸对小鼠蛋白表达的影响

Western blot 检测结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠脑组织中磷酸化PI3K、磷酸化AKT蛋白表达均显著降低，磷酸化NF-κB及其比值显著升高（P<0.05）；与模型组比较，脉络舒通丸可增加磷酸化PI3K、磷酸化AKT蛋白表达，降低磷酸化NF-κB蛋白表达（P<0.05），见图6。

缺血性卒中是由一系列炎性级联反应相互作用引起的复杂的病理生理过程，发病率高，致死率可达5%~15%，炎性反应是导致缺血性卒中发生发展的重要因素。缺血性卒中属中医“中风”范畴，寒凉派创始人刘完素认为中风乃五志化火所致，提出中风火热病机学说。朱丹溪则以气虚且痰湿自盛立论，提出了湿痰生热生风之说。血瘀是缺血性脑卒中患者恢复期病因的核心，贯穿中风病的始终。根据缺血性脑卒中中药用药规律，黄芪、芍药、当归、甘草等中药在卒中患者的活血化瘀、补中益气中使用频率较高。张锡纯治疗中风时黄芪必配当归同用。虫类药性走窜，活血力强，古代医家常在中风方中应用。脉络舒通颗粒/丸源自国医大师唐祖宣多年临床经验方，由二妙散、止痉散、四妙勇安汤、当归补血汤、芍药甘草汤等5个方剂融合而成。方中，重用黄芪，芪以活血通络，金银花解毒消肿，二者合为君药；黄柏、苍术、薏苡仁清热祛湿，白芍、当归、甘草缓急止痛，当归与黄芪配伍可使气旺血行，瘀祛络通，玄参凉血解毒，均为臣药；水蛭、蜈蚣、全蝎攻毒散结、活络止痛，为佐药；甘草调和诸药。五方有机融合并进行加味后，达到了优势互补的效果，切中中风气虚血瘀之病机。脉络舒通丸具有抗炎、溶栓、消肿止痛的作用，促生长因子分泌作用显著，能够调节血管内皮功能，对血脂、血压水平稳定也能起到积极促进作用。

本研究基于网络药理学方法，通过脉络舒通丸的“活性成分-靶点-疾病”网络，挖掘药物治疗缺血性卒中的关键作用靶点，为阐明中药药效物质基础和作用机制提供指导。结果显示，脉络舒通丸共有222个活性成分和701个作用靶点。前10位成分中，包括5个黄酮类、3个萜类化合物，显示了潜在的药理活性，如β-谷甾醇、槲皮素、甘乌内酯、甘草查尔酮B等，黄酮类成分可抑制血小板聚集，抑制炎症反应，抑制细胞凋亡来发挥抗脑缺血作用，萜类抵抗氧化应激和炎症损伤，对卒中愈后具有重要作用。黄芪是中医治疗缺血性脑血管病的常用药物，其中黄酮类、总苷类是其主要的药效物质基础。水蛭中的活性成分通过清除自由基、抑制血管内皮损伤、降低血小板活化、抗凋亡、抗炎等机制发挥治疗脑血管疾病的作用。甘草中的黄酮类和三萜类化合物具有抗炎、降血脂和血糖、抗动脉粥样硬化等作用。植物甾醇被誉为“生命钥匙”，β-谷甾醇、豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗血凝等生物活性，槲皮素具有抗氧化、神经保护、免疫调节等作用。

脉络舒通丸治疗缺血性卒中的核心靶点包括AKT1、CTNNB1、JUN、MAPK1、MAPK3、PIK3CA、PIK3R1、RELA、STAT3。根据KEGG通路富集分析，脉络舒通丸治疗缺血性卒中作用与PI3K/AKT、MAPK、肿瘤坏死因子、NF-κB、细胞凋亡等信号通路有关。PI3K/AKT是一条促细胞生存的通路，具有调节细胞增殖、分化、代谢、抗凋亡等作用，在脑缺血性损伤早期，该通路被激活，诱导细胞凋亡、炎症反应等，随着缺血程度加重，其活性逐渐被抑制。NF-κB以复杂的分子机制参与到机体的炎症反应中，NF-κB的活化可促使炎症因子表达，从而介导炎性损伤。MAPK信号通路在炎症、神经细胞凋亡、脑水肿、缺血再灌注损伤等方面发挥重要的调控作用，影响脑卒中的疾病进展。中药成分复杂，结构类似的成分作用靶点相同或接近，脉络舒通丸多种有效成分通过作用于PI3K/AKT/NF-κB通路上的多个靶点发挥治疗缺血性卒中的作用。

已有文献报道脉络舒通丸能通过抑制NF-κB的转录，降低通路上炎症因子的表达，起到抗动脉粥样硬化的作用。基于网络药理学结果，本研究分别运用分子对接技术和动物实验，对PI3K/AKT/NF-κB通路的靶点进行验证。degree排名前10位的成分与PI3K、AKT1、RELA分别进行分子对接，结果10个成分中，9个与PI3K、10个与AKT1、4个与RELA具有极强的结合能力（≤－7.0kcal·mol^-1）。采用阻断大脑中动脉引起脑局部缺血法建立小鼠缺血性卒中模型，通过脉络舒通丸治疗，缺血性卒中小鼠脑梗死体积占比显著减小，说明脉络舒通丸对脑卒中小鼠具有一定的治疗作用。脉络舒通丸组小鼠脑组织中p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显升高，p-NF-κB蛋白表达明显降低。进一步表明脉络舒通丸治疗缺血性卒中的作用可能通过调节PI3K/AKT、NF-κB发挥作用。

综上所述，本研究基于网络药理学、分子对接及小鼠缺血性卒中模型，以脉络舒通丸为研究对象，探讨其治疗缺血性卒中的机制。脉络舒通丸可能通过激活小鼠脑组织中PI3K/AKT/NF-κB通路，抑制细胞凋亡，抑制炎症反应，达到缺血后脑保护的作用，为研究脉络舒通丸治疗缺血性卒中的作用机制提供了部分科学依据，后期将对其信号通路进行深入验证。